Bakterielle Persistenz oder Antibiotikatoleranz versus – ~resistenz
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können Bakterien altruistisch sein?
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Einleitung
Verbreitung
Toleranz vs Resistenz
Medizinische Bedeutung
Phänomenologie und molekulare Charakteristika
Molekular sind Persister bislang ungenügend charakterisiert
Altruismus?
Persisterzelle von E. coli MG1655 hipA7 neben einer durch Ampicillin abgetöteten Schwesterzelle

 

Einleitung
Im Jahre 1944 experimentierte der Arzt und Mayor Joseph Bigger mit dem relativ neuen Antibiotikum Penicillin. Er stellte fest, dass Penicillin wachsende Kulturen von Staphylococcus aureus abtötet, einige Individuen jedoch auch nach bis zu 11 Tagen noch lebten. Er taufte diese überlebenden Zellen “Persister”.
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Verbreitung

Alle bisher untersuchten Bakterien bilden Persister. Einige Gram positive Arten wie Enterococcus faecalis bilden in der stationären Phase sogar 100 % Persister aus.
Der am eindrucksvollsten persistierende Organismus ist zweifelsohne Mycobacterium tuberculosis, der Errger der Tuberkulose, der über Jahre in diesem Zustand verbleiben kann und daher sehr schlecht auf Antibiotikatherapie anspricht.
Auch bei Eukaryoten existiert dieses Phänomen: Die Hefe Candida albicans bildet Persister aus.

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Toleranz vs Resistenz
Bakterien können durch Mutationen, Aufnahme von Enzymen, die Antibiotika deaktivieren, Überexpression von „multidrug pumps“ oder Veränderung ihrer Zellstruktur gegen alle bekannten Klassen von Antibiotika resistent werden. Die Wahrscheinlichkeit für die Entwicklung von Resistenz liegt zwischen 10-5(sprich, alle 100.000 Bakterienzellen ist eine resistent) und 10-16 (sprich: Resistenzentwicklung so gut wie unmöglich). Was unterscheidet tolerante von resistenten Bakterien? Resistenz ist vererbbar. Wenn man eine Bakterienkultur mit einem Antibiotikum abtötet und sich resistente Zellen darin befinden, so wird die nachwachsende Kultur zu 100 % resistent sein. Tötet man eine Kultur ohne Resistenzentwicklung ab, so bleiben Persister übrig, wenn diese eine neue Kultur formen, so ist diese jedoch nicht weniger anfällig gegenüber dem Antibiotikum. Resistente Bakterien können in der Regel in der Präsenz eines Antibiotikums wachsen. Persister sind nicht oder langsam wachsende Zellen. Persister sind also Zellen, die unter Antibiotikaeinfluss weder wachsen noch sterben.
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Medizinische Bedeutung

Persister sind wohl in erster Linie für wiederaufflammende Infektion nach Absetzen einer Antibiotikatherapie verantwortlich. Dies ist insbesondere ein Problem bei Biofilmproduzenten. Biofilme sind gewisssermaßen Schleimschutzschilde, mit denen sich viele Bakterien umgeben können. Durch Antibiotika nicht abgetötete Persister sind in diesen gegen das Immunsystem abgeschirmt und können somit nach Absetzen des Antibiotikums den Infektionsherd neu besiedeln. Unter anderem aus diesem Grund ist die von Pseudomonas aeruginosa verursachte cystische Fibrose sehr schwer zu behandeln (ein weiterer Grund ist die Vielzahl an Antibiotikapumpen, die dieser Organismus besitzt).

 

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Phänomenologie und molekulare Charakteristika
Die Phänomenologie der Persistenz (oder auch: Wann werden Persister wo und warum wie gebildet?) wurde eingehend von Bigger selbst, Harrison Moyed’s Labor sowie Thomas Hill und Kim Lewis untersucht. Persister werden nur in der mitt-logarithmischen bis stationären Wachstumsphase gebildet. Dieser als „shootup“ bezeichnete Anstieg in der Fraktion persistenter Zellen legt eine quorum-sensing-gesteuerte Genese nahe; ein Auslöschen aller bekannter quorum-sensing- Gene verhinderte Persisterbildung jedoch nicht. (Quorum sensing ist die Fähigkeit von Bakterien, durch Signalchemikalien, die in das Wachstumsmedium abgegeben werden, die Zellzahl zu spüren und daraufhin die Transkription bestimmter Gene zu steuern.) Persister sind tolerant gegen alle bislang untersuchten Klassen von Antibiotika. Sogar membranschädigende Antibiotika töten nicht alle Zellen, was für eine veränderte Membrankomposition dieser toleranten Zellen spricht. Wie genau Persistenz zu definieren ist, ist allerdings bislang unklar. Theoretisch kann jedes Antibiotikum eine physiologisch distinkte Persisterpopulation „verursachen“. Versuche zum „Aufwachzeitpunkt“ persistenter Zellen zeigten, dass es innerhalb dieser Subpopulation weitere Subpopulationen gibt, die sich z.B. in der Länge des persistenten Zustandes und der verschiedenartigen Toleranz gegenüber verschiedenen Antibiotika unterscheiden. Die Schwierigkeit, das Phänomen zu definieren zeigt sich am Beispiel zweier Antibiotika: Ampicillin greift die Zellwandsynthese an und tötet nur wachsende Zellen. In der stationären Phase sind somit 100 % der Zellen tolerant gegenüber Ampicillin (und erfüllen damit eigentlich die Definition von Persistern: Sie wachsen nicht und sterben nicht). Versetzt man Bakterien in der stationären Wachstumsphase jedoch mit Ciprofloxacin (hemmt DNA – gyrase und Topoisomerase 4 und führt somit zu Doppelstrangbrüchen des Chromosoms), so sterben 99.9 – 99.999 % der Zellen innerhalb von 6 Stunden – doch auch hier überlebt ein winziger Bruchteil von Persistern. Der Anteil an Persistern in einer Kultur schwankt zwischen Organismen und Wachstumsphasen. Generell können 0.0001 bis 10 % (bis, in Sonderfällen, 100 %) der Zellen persistent sein.
Typische, biphasische Abtötungskurve: E. coli K12 in der stationären Phase erlebt nach
Zugabe von Ofloxacin einen starken Abfall der Lebendzellzahl (fast 3 logarithmische
Einheiten = 99.9 % der Zellen sind tot) innerhalb der ersten 3 Stunden und bleibt dann
für bis zu 14 Tage auf diesem Level.
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Molekular sind Persister bislang ungenügend charakterisiert
Harrison Moyed isolierte in den 80iger Jahren eine Mutante namens hipA7 (hip für „high persistence“), die in der logarithmischen Phase eine 10 bis 100fache erhöhte Persisterbildung zeigte. Das Gen hipA ist mittlerweile als Teil eines Toxin-Antitoxin-locus charakterisiert. HipA ist toxisch; der Toxizität wird jedoch vom Produkt des Genes hipB entgegengewirkt. Diese Toxin-Antitoxin-Loci sind weit verbreitet unter Bakterien. Eine physiologische Rolle konnte bislang nicht einwandfrei aufgeklärt werden. Für die Persisterbildung sind es jedoch ideale Kandidaten: Ein Bakterium könnte sich selbst „vergiften“, somit einen kontrollierten Wachstumsstop vollführen. Im Falle des oben erwähnten Ciprofloxacin könnte das wie folgt aussehen: Ciprofloxacin inhibiert die Religationsreaktion von Topoisomerasen. Topoisomerasen führen Doppelstrangbrüche in DNA ein, entwinden die DNA sodann und schweißen sie dann wieder zusammen. Die tödliche Wirkung Ciprofloxacins ist also davon abhängig, dass die Zielenzyme ihre Arbeit verrichten. Wenn eine Zelle nun aber einen Weg findet, diese Ziele zu blockieren, so wird Ciprofloxacin wirkungslos. Diese Hypothese zu testen ist jedoch sehr schwer: E. coli besitzt 10 bekannte TA-Loci, Mycobacterium tuberculosis sogar 60. Einen knockout aller TA-Loci zu erzeugen ist somit sehr aufwändig. Höchstwahrscheinlich gibt es darüber hinaus viele verschiedene Wege, wie Zellen in den Zustand der Persistenz verfallen können. In den nächsten Jahren ist auf diesem Gebiet mit großen Fortschritten zu rechnen.
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Altruismus?
Streng genommen scheint Persistenz eine Art primitiver Altruismus zu sein: Jede Bakterienpopulation produziert Zellen, die „darauf verzichten“, ihre Gene durch Zellteilung zu vermehren. Vielmehr bilden diese Zellen den Rückhalt für eine Population, wenn diese mit einem plötzlichen Stress (Antibiotika, Austrocknung, Hitze) konfrontiert wird. Anthropomorphistisch ausgedrückt verzichten Persister also auf den essentiellen Wunsch allen Lebens (Vermehrung), um potentiell zum Wohle der Gesamtpopulation bereitzustehen.
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Quellen
Lewis, K (2007): Persister cells, dormancy and infectious disease, Nature Reviews Microbiology 5(1)
Fotos
Alle Abbildungen: Tobias Dörr

 

Tobias Dörr, April 2007


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Konzept und technische Umsetzung: S. von den Berg